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血清总补体溶血活性(CH50)测定操作说明书

点击次数:916  日期:2018/7/6 12:37:36

血清总补体溶血活性(CH50)实验原理
利用绵羊细胞与相应抗体(溶血素)结合成的复合物,可激活血清中的补体,导致红细胞溶解,当红细胞和溶血素量一定时,在规定反应的时间内,溶血程度与补体量及活性呈正相关。在接近50%溶血(CH50)时,二者之间近似直线关系,故以50%溶血作为最敏感的判断终点。以引起50%溶血所需的最小补体量为一个CH50U,可计算出待测血清中总的补体溶血活性,以CH50U/ml表示。
 
本试验主要反映补体经典活化途径的溶血功能,其结果与补体C1~C9各组成分的量及活性均有关。
1.试剂及配制
(1)缓冲生理盐水:
①贮存液:
lNa2HPO4•12H2O     2.85g
lKH2PO4             0.27g(加蒸馏水至100毫升,4℃保存)
lNaCl               17.00g
②应用液(缓冲液):5毫升贮存液加95毫升蒸馏水,再加10%硫酸镁0.1毫升。当日配制。12小时内使用。
(2)2%绵羊红细胞(From:南京森贝伽生物公司):无菌采取绵羊血液,于等量Alsever液中可保存3周。用前以缓冲液洗3次,并配成2%细胞悬液。必要时可用吸光光度法或细胞计数法使悬液细胞浓度标准化。
(3)冻干绵羊红细胞溶血素(From:南京森贝伽生物公司)(规格:0.5ml/瓶,0.5ml蒸馏水复溶):将本品(效价1:4000),用缓冲液作1:2000倍稀释(即0.5ml溶血素加999.5毫升缓冲液)。
(4)待测血清:新鲜血液室温放置30分钟,再4℃放置60分钟,使血块收缩。4℃离心(3000r/min)10分钟,取上清,-20℃保存。
2.试管法操作步骤(改良Mayer法)
(1)致敏羊红细胞:2%绵羊红细胞加等量稀释后的溶血素(1:2000),混匀,置37℃水浴30分钟。
(2)稀释血清:待测血清0.2ml,加缓冲液3.8ml,稀释度为1:20。
(3)配制溶血标准管:2%绵羊红细胞2ml加8ml蒸馏水,混匀,即为全溶血管。取全溶血管液2ml加缓冲液2ml,即为50%溶血管。
(4)按表所示,依次加各成分于试管中,混匀,置37℃水浴30分钟。第10管为非溶血对照。

补体CH50测定试管法

    

          

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

120待测血清

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

-

缓冲液(ml)

1.40

1.35

1.30

1.25

1.20

1.15

1.10

1.05

1.00

1.50

致敏红细胞(ml

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

(5)结果测定:取出试管,2000r/min离心10分钟,对照管应不溶血。肉眼比色,选与50%溶血标准管相近二管,再用分光光度计测(波长542nm、0.5cm比色杯)OD值,确定与标准管最接近者为终点管,然后按下公式计算CH50值:血清补体CH50(U/ml)=(1/血清用量)×稀释度。
如第5管为终点管,测待测血清中CH50为66.7U/ml。血清补体CH50正常值为50-100U/ml。
 
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