活性氧检测试剂盒使用说明书下载

点击下载日期：2014/10/14 8:54:35

活性氧检测试剂盒
产品简介：
产品编号产品名称产品包装
SBJ0033 活性氧检测试剂盒>100 次
活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA
进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，
可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到
细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH 生成有荧光的DCF。检测DCF 的荧光就可
以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup 是一种混合
物(compoundmixture),浓度为50mg/ml。
本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。
本试剂盒可以测定100-500 个样品。
包装清单：
产品编号产品名称包装
SBJ0033-1 DCFH-DA(10mM) 0.1ml
SBJ0033-2 活性氧阳性对照(Rosup, 50mg/ml) 1ml
— 说明书1 份
使用说明：
1. 装载探针
对于刺激时间较短(通常为2 小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自
己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6 小时以上)的细胞，先用活性氧
阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000 用无血清培养液稀释
DCFH-DA，使终浓度为10 微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。
加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA 不少于
1 毫升。37℃细胞培养箱内孵育20 分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除
未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30 分钟后可以显著提高活性
氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1:1000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 微摩
尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA 中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细
胞培养箱内孵育20 分钟。每隔3-5 分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清
细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或
自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺
激细胞20-30 分钟后可以显著提高活性氧水平。
南京森贝伽生物科技有限公司
说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup 作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。
2. 检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光
光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光
度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3. 参数设置
使用488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF
的荧光光谱和
FITC 非常相似，可以用FITC 的参数设置检测DCF。DCF 的激发光谱和发射光谱参考下
图。
4. 其它说明
阳性对照可以按照1:1000 的比例使用。例如装载好探针的细胞共1 毫升，可以加入1
微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对
于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 分钟内观察不
到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当
降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照
1:2000-1:5000 稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA 的浓度为2-5 微摩尔/升。探针装载的
时间也可以根据情况在15-60 分钟内适当进行调整。
活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入
活性氧阳性对照。
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认
探针的装载情况是否良好。DCF 的激发光谱和发射光谱请参考下页图谱。
尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。