免疫组化的实验总结

点击次数：7787 日期：2014/3/27 15:27:58

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学.

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体.
操作要点和技巧

1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液.对于冰冻切片,甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原,可选用不同的固定液.有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液,请于购置前注意说明书.
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织的穿透力较强,固定较好,结构完整,但因偏酸,对抗原有一定损害,且组织收缩明显,不适于组织标本的长期保存.
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛,适于固定石蜡切片.适于富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好.

2．组织脱水,透明：时间不能太长,否则在切片时容易碎片,切不完整.

3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开,这时可适当地在水中加入几滴乙醇.

4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜,温度太高或时间太长,抗原容易丢失.

5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存

6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂,6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液,适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理.如不行,可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片.在以上两种条件都行不通的情况下,可用如下方法：切片在脱蜡前,放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟,晾干,即可进行下一步.

7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活.

8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时,必须采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书).对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化.胶原还可以用胃蛋白酶消化等.

9．封闭：在山羊血清封闭,非特异性染色仍然较强时,可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则,对于PBS稀释的抗体一定要当天使用.

11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下,如果背景依旧高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特别是在显色之前要多洗.

12．返蓝：在苏木素复染后,可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝.

13．显色：一定要在显微镜下观察,注意控制背景.