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细胞毒试验的几种方法
点击次数：4235 日期：2014/1/11 14:05:31
细胞毒试验实在组织培养中研究淋巴细胞、抗体或抗体依赖性淋巴细胞杀伤靶细胞的一种技术,也是在体外研究特异性细胞免疫比较可靠和灵敏的方法,目前微量细胞毒试验是应用最广的一种方法.
（一）淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒试验方法：
1) 肿瘤细胞培养物制成悬液,并稀释至需要的细胞浓度.
2) 于微量试验班的小孔内分别接种0.2ml肿瘤细胞（内含5×102）个细胞,37℃培育24h.
3) 细胞贴壁后,轻轻轻去培养基,加1mlPBS洗涤,轻去洗涤液及未贴壁细胞.
4) 向小孔分别加入0.2ml不同浓度的淋巴细胞（分别含有5×105个细胞,5×104个细胞,5×103个细胞）,使淋巴细胞与癌细胞之比依次为1000：1、100：1、10：1.
5) 45min后加0.1ml5%胎牛血清,37℃继续培养2-3天.
6) 2%台盼蓝染色,翻转微量试验班,计数活存的肿瘤细胞,并设正常人淋巴细胞代替肿瘤患者淋巴细胞作对照,每份需同时做3个复孔,分别检查各孔中存活活细胞数,按下列公式计算细胞毒率,并做t检验.
（二） 抗体加补体的细胞毒试验方法：
此法是组织相容性抗原（HLA）检查技术中最常用的一种方法.也称微量淋巴细胞毒试验.人体的组织相容性抗原存在于淋巴细胞膜的表面,从供者与受者的血液分离淋巴细胞作为靶细胞,以各种定型单价抗血清与家兔血清补体作为效应系统.如果淋巴细胞表面具有与抗血清相对应的抗原,则淋巴细胞就会受损伤或致死而被台盼蓝染色.
1、 材料：
a.淋巴细胞
b. 血清.小牛血清（56℃灭活30min）
c.待测血清.收集多产妇分娩时的胎盘剥离后的血,分出血清,叠氮纳防腐,4℃保存.
d.已知阳性对照血清.用上海市中心血站制备的马抗人淋巴细胞血清（ALS）,同时做1：3稀释.
e.补体.新鲜家兔混合血清,分装小试管,保存于-20℃.
2、 操作步骤：
a.在塑料试验盒内加入医用液体石蜡油20ml,放进一块52孔微量玻璃试验班,使板沉至盒底.
b.用0.25ml的微量定量加液器分别加入待测血清和阳性对照血清2-2ul/孔,阴性对照用Hanks液代之.加样针尖应磨平.
c.用同法每孔内加入待测的淋巴细胞2-3ul,应先加阴性对照和补体对照孔,然后加待测孔,最后加阳性血清对照孔,加后轻摇使其混匀,置室温作用1h.
d.每孔加入兔补体5-7ul（按加淋巴细胞顺序加入）,置37℃培育45min（或室温作用1h）.
e.每孔加入2%台盼蓝等渗液3-5ul室温中静置20min,吸去蓝色上清.
f.普通显微镜检查,记录每孔中死细胞（着色细胞）数.
死细胞.体积稍大,着蓝色,无折光性.
活细胞.大小正常,未着色,较透亮.
判断标准（每次实验,需做3-6个复本）.
其中着色细胞：《=20%为阴性, 20%--50%为弱阳性, 50%--70%为阳性, 》=70%为强阳性.
（三）ADCC试验：
抗体依赖细胞介导细胞毒作用用来检查K细胞的Fc受体,该细胞结合抗体杀伤靶细胞的作用是非特异性的,故称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC).
（四） NK细胞毒试验之51Cr稀放法：
1) 效应细胞的制备
用常规的Fico11分离法分离外周血中的耽搁核细胞,经玻璃瓶37℃贴壁2h,以除去单核-巨噬细胞,计数活细胞数,使细胞浓度为5×106个/ml,细胞存活率为95%以上（小鼠可用鼠脾细胞）.
2) 靶细胞制备
取培养24-48h的K562细胞,培养基洗一次,用营养液配成4×106个/0.5ml,加3.7MBq 51Cr,37℃水浴90min隔15min摇匀一次,然后洗涤3次,除去游离的51Cr,计数活细胞,稀释细胞数达1×105个/ml.
3) NK细胞活性测定
用4h短程稀放法,自然杀伤组效应细胞/靶细胞（50：1）各0.2ml,自然稀放组以营养液代替效应细胞,最大稀放组以2%SDS代替效应细胞,分别置37℃接触4h,然后各管加冷Hanks液0.6ml终止反应,离心（1000r/min）10min,吸上清0.5ml,用γ计数器测放射性.
（五）NK细胞毒试验之3H-TdR法：
取培养24-48h的K562靶细胞,稀释至5 × 104个/ml,效应细胞为人外周血单个核细胞,制成5 × 106个/ml细胞悬液,加入微板中,每孔加入靶细胞与效应细胞各0.1ml,靶细胞自然掺入对照组仅加入靶细胞悬液0.1ml,用RPMI 1640培养基0.1ml代替效应细胞,每组均设3个复孔,加入细胞悬液后,每孔立即加入3H-TdR37kBq,然后置于37℃、5%CO2中培养20h,收集细胞于纤维滤纸上,用γ计数器测定cpm,用特异抑制百分率（Pi）表示NK细胞活化.
（六）NKCF检测（MTT法）：
培养3天的K562细胞经完全培养基洗涤1次后配成2.5×105个/ml细胞悬液,在微孔培养板上加入50ul/孔,再加入含NKCF标本50ul/孔,标本不同稀释度为1：2、1：4、1：8、1：16、、、、、、,阴性对照为无NKCF的培养基,阳性对照为蒸馏水,每份标本设3个复孔取其平均值,另设1个无细胞空白对照.置37℃、5%CO2培养箱中培养24h,加MTT厚的过程与活细胞检测基本相同.按公式计算各稀释度的NKCF值.
此外还有台盼蓝排除法,通过计算细胞死亡率（或存活率）来表示NK细胞的杀伤活性,方法简便易行,但有客观因素影响,对NK细胞的杀伤效应也可采用MTT法.
（七）LAK细胞毒试验之125I释放法：
（1）LAK细胞的制备 经乙醚麻醉后,无菌取鼠脾脏,淋巴细胞经挤压后,用4层纱布过滤,经3次离心洗涤,制成细胞悬液,将浓度调至107个/ml,加IL-2制品1ml,置于37℃、5%CO2孵育5天,存活的淋巴细胞可作为LAK细胞使用.
（2）LAK细胞体外毒活性测定 用125I脱氧尿嘧啶核苷标记WBT-2M纤维肉瘤靶细胞,每106个细胞加125I尿嘧啶核苷148kBq,37℃静置培养14h,接着用Hanks液离心3次,充分洗涤,然后分别与效应细胞置微量培养板中共同孵育6h,吸取上清,用γ计算器测定同位素的释放量,按公式计算其细胞毒的百分率.
（八）CTL的细胞毒试验：
取淋巴细胞1 × 106个/ml,经ConA 3ug/ml刺激培养5天获效应CTL,靶细胞为用125I-UdR标记的肥大细胞瘤P815细胞或者为K562细胞,其方法为每孔加入50ulCTL,70ul含1 × 104个125I-UdR标记的P815细胞及30ul 1/25稀释的PHA,微孔经1200r/min离心5min后,37℃培养3.5h后取出,再加入0.5%胰蛋白酶50ul再培养30min后以1200r/min离心,取每孔中上清100ul加入小玻璃管中,将每孔中的细胞收获于玻璃纤维质上,用γ计算器分别测上清及细胞中cpm值,按公式计算杀伤效应.
（一）淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒试验方法：
1) 肿瘤细胞培养物制成悬液,并稀释至需要的细胞浓度.
2) 于微量试验班的小孔内分别接种0.2ml肿瘤细胞（内含5×102）个细胞,37℃培育24h.
3) 细胞贴壁后,轻轻轻去培养基,加1mlPBS洗涤,轻去洗涤液及未贴壁细胞.
4) 向小孔分别加入0.2ml不同浓度的淋巴细胞（分别含有5×105个细胞,5×104个细胞,5×103个细胞）,使淋巴细胞与癌细胞之比依次为1000：1、100：1、10：1.
5) 45min后加0.1ml5%胎牛血清,37℃继续培养2-3天.
6) 2%台盼蓝染色,翻转微量试验班,计数活存的肿瘤细胞,并设正常人淋巴细胞代替肿瘤患者淋巴细胞作对照,每份需同时做3个复孔,分别检查各孔中存活活细胞数,按下列公式计算细胞毒率,并做t检验.
（二） 抗体加补体的细胞毒试验方法：
此法是组织相容性抗原（HLA）检查技术中最常用的一种方法.也称微量淋巴细胞毒试验.人体的组织相容性抗原存在于淋巴细胞膜的表面,从供者与受者的血液分离淋巴细胞作为靶细胞,以各种定型单价抗血清与家兔血清补体作为效应系统.如果淋巴细胞表面具有与抗血清相对应的抗原,则淋巴细胞就会受损伤或致死而被台盼蓝染色.
1、 材料：
a.淋巴细胞
b. 血清.小牛血清（56℃灭活30min）
c.待测血清.收集多产妇分娩时的胎盘剥离后的血,分出血清,叠氮纳防腐,4℃保存.
d.已知阳性对照血清.用上海市中心血站制备的马抗人淋巴细胞血清（ALS）,同时做1：3稀释.
e.补体.新鲜家兔混合血清,分装小试管,保存于-20℃.
2、 操作步骤：
a.在塑料试验盒内加入医用液体石蜡油20ml,放进一块52孔微量玻璃试验班,使板沉至盒底.
b.用0.25ml的微量定量加液器分别加入待测血清和阳性对照血清2-2ul/孔,阴性对照用Hanks液代之.加样针尖应磨平.
c.用同法每孔内加入待测的淋巴细胞2-3ul,应先加阴性对照和补体对照孔,然后加待测孔,最后加阳性血清对照孔,加后轻摇使其混匀,置室温作用1h.
d.每孔加入兔补体5-7ul（按加淋巴细胞顺序加入）,置37℃培育45min（或室温作用1h）.
e.每孔加入2%台盼蓝等渗液3-5ul室温中静置20min,吸去蓝色上清.
f.普通显微镜检查,记录每孔中死细胞（着色细胞）数.
死细胞.体积稍大,着蓝色,无折光性.
活细胞.大小正常,未着色,较透亮.
判断标准（每次实验,需做3-6个复本）.
其中着色细胞：《=20%为阴性, 20%--50%为弱阳性, 50%--70%为阳性, 》=70%为强阳性.
（三）ADCC试验：
抗体依赖细胞介导细胞毒作用用来检查K细胞的Fc受体,该细胞结合抗体杀伤靶细胞的作用是非特异性的,故称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC).
（四） NK细胞毒试验之51Cr稀放法：
1) 效应细胞的制备
用常规的Fico11分离法分离外周血中的耽搁核细胞,经玻璃瓶37℃贴壁2h,以除去单核-巨噬细胞,计数活细胞数,使细胞浓度为5×106个/ml,细胞存活率为95%以上（小鼠可用鼠脾细胞）.
2) 靶细胞制备
取培养24-48h的K562细胞,培养基洗一次,用营养液配成4×106个/0.5ml,加3.7MBq 51Cr,37℃水浴90min隔15min摇匀一次,然后洗涤3次,除去游离的51Cr,计数活细胞,稀释细胞数达1×105个/ml.
3) NK细胞活性测定
用4h短程稀放法,自然杀伤组效应细胞/靶细胞（50：1）各0.2ml,自然稀放组以营养液代替效应细胞,最大稀放组以2%SDS代替效应细胞,分别置37℃接触4h,然后各管加冷Hanks液0.6ml终止反应,离心（1000r/min）10min,吸上清0.5ml,用γ计数器测放射性.
（五）NK细胞毒试验之3H-TdR法：
取培养24-48h的K562靶细胞,稀释至5 × 104个/ml,效应细胞为人外周血单个核细胞,制成5 × 106个/ml细胞悬液,加入微板中,每孔加入靶细胞与效应细胞各0.1ml,靶细胞自然掺入对照组仅加入靶细胞悬液0.1ml,用RPMI 1640培养基0.1ml代替效应细胞,每组均设3个复孔,加入细胞悬液后,每孔立即加入3H-TdR37kBq,然后置于37℃、5%CO2中培养20h,收集细胞于纤维滤纸上,用γ计数器测定cpm,用特异抑制百分率（Pi）表示NK细胞活化.
（六）NKCF检测（MTT法）：
培养3天的K562细胞经完全培养基洗涤1次后配成2.5×105个/ml细胞悬液,在微孔培养板上加入50ul/孔,再加入含NKCF标本50ul/孔,标本不同稀释度为1：2、1：4、1：8、1：16、、、、、、,阴性对照为无NKCF的培养基,阳性对照为蒸馏水,每份标本设3个复孔取其平均值,另设1个无细胞空白对照.置37℃、5%CO2培养箱中培养24h,加MTT厚的过程与活细胞检测基本相同.按公式计算各稀释度的NKCF值.
此外还有台盼蓝排除法,通过计算细胞死亡率（或存活率）来表示NK细胞的杀伤活性,方法简便易行,但有客观因素影响,对NK细胞的杀伤效应也可采用MTT法.
（七）LAK细胞毒试验之125I释放法：
（1）LAK细胞的制备 经乙醚麻醉后,无菌取鼠脾脏,淋巴细胞经挤压后,用4层纱布过滤,经3次离心洗涤,制成细胞悬液,将浓度调至107个/ml,加IL-2制品1ml,置于37℃、5%CO2孵育5天,存活的淋巴细胞可作为LAK细胞使用.
（2）LAK细胞体外毒活性测定 用125I脱氧尿嘧啶核苷标记WBT-2M纤维肉瘤靶细胞,每106个细胞加125I尿嘧啶核苷148kBq,37℃静置培养14h,接着用Hanks液离心3次,充分洗涤,然后分别与效应细胞置微量培养板中共同孵育6h,吸取上清,用γ计算器测定同位素的释放量,按公式计算其细胞毒的百分率.
（八）CTL的细胞毒试验：
取淋巴细胞1 × 106个/ml,经ConA 3ug/ml刺激培养5天获效应CTL,靶细胞为用125I-UdR标记的肥大细胞瘤P815细胞或者为K562细胞,其方法为每孔加入50ulCTL,70ul含1 × 104个125I-UdR标记的P815细胞及30ul 1/25稀释的PHA,微孔经1200r/min离心5min后,37℃培养3.5h后取出,再加入0.5%胰蛋白酶50ul再培养30min后以1200r/min离心,取每孔中上清100ul加入小玻璃管中,将每孔中的细胞收获于玻璃纤维质上,用γ计算器分别测上清及细胞中cpm值,按公式计算杀伤效应.
