ELISA实验中制备抗体酶结合物的通常方法

 酶标记的抗原或抗体称为结合物。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合。如蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。

1.戊二醛交联法
戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或者其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。举例如下：2mg~5mg纯抗体与5mg AP 混合与0.1mol/L pH6.8的磷酸缓冲液1mL中，4℃下对相同缓冲液透析平衡。磁力搅拌下，缓慢加入1%戊二醛0.05mL，在室温下放置2h。在4℃下对0.05mol/L pH8.0Tris缓冲液透析平衡，即得酶标抗体。辣根过氧化酶可溶解于50%饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用50%饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体，弃去上清中游离酶。戊二醛一步法操作简单、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。
2.过碘酸盐氧化法
本法只用于HRP的交联。该酶含18%碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼酸氢钠中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化酶交联的最有效的方法。但也有人认为由于所有试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。
按以上的方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子混合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法操作简单，但效果不如用SephadexG-200凝胶过滤的好。